中科院遗传发育所开发TKO与“多合一”TRIM基因组编辑系统，实现作物复杂性状“一站式”精准聚合

在现代农业作物育种进程中，虽然大量优异等位基因已陆续被测序鉴定，但如何将其快速且精准地聚合至同一品种中，始终面临着跨世代多轮杂交与反复试验优化的技术瓶颈。中国科学院遗传与发育生物学研究所（Institute of Genetics and Developmental Biology, CAS）科研团队成功攻坚，开发出精准基因敲除工具TKO以及“多合一”复合基因组编辑系统TRIM（Targeted Replacement, Insertion and Mutagenesis），为复杂农艺性状的“一站式”定向改良开辟了新途径。

针对常规基因编辑在多倍体作物与多基因协同改良中周期冗长、效率受限的挑战，研究团队基于双导向RNA引导编辑策略（twin prime editing, twinPE），研发出靶向定点插入终止密码子簇（Stop codon clusters）的高效敲除工具TKO。该工具能够通过精准写入终止密码子实现目标基因的确定性失活，从机制上规避了传统CRISPR/Cas9核酸酶因非同源末端连接（NHEJ）易引入框内突变（In-frame mutations）的问题。实验表明，TKO在水稻、小麦及玉米等主要单子叶作物的原生质体中表现出优异的编辑活性，在水稻再生T0代植株中的单基因平均敲除效率高达96.8%。在此基础上构建的10套相互正交的TKO体系，成功实现了单株多达10个基因的同步精准敲除。

为了进一步突破不同类型基因编辑依赖分散工具的局限，团队提出了“多合一”编辑架构，先后开发出TRIM1与TRIM2两套集成系统。在水稻T0代植株的验证中，TRIM1实现了同步完成1个基因的敲除以及3个不同基因的纯合精准编辑，复合编辑效率达22.8%；而进一步升级的TRIM2系统不仅保留了TRIM1的全部敲除与碱基编辑能力，更打通了千碱基（Kb）级大片段DNA的定点插入、替换、缺失、倒位与染色体易位等高阶基因组重构操纵。

为大幅降低生物信息学设计与湿实验载体构建的门槛，科研团队同步开发了配套的自动化设计软件TKO_PegDesigner，并建立了基于两轮连接的多(pe)gRNA高效组装策略，单次反应最多可完成36个(pe)gRNA的高通量组装。TRIM系统首次在国际上将基因失活敲除、精准核苷酸编辑及大尺度染色体工程重构集成于同一技术底座，为主要粮油作物的定向分子设计育种和关键优异性状的规模化聚合提供了强大的底层工程化工具支撑。